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ATPase/GTPase bactériennes : résistance aux antibiotiques et nouvelles cibles. (JM Jault)

Introduction
Notre équipe s’intéresse principalement aux protéines bactériennes avec deux objectifs majeurs :
Comprendre le mécanisme de fonctionnement de transporteurs de multiples drogues impliqués dans la résistance aux antibiotiques ;
Caractériser le rôle et le fonctionnement de nouvelles enzymes spécifiquement bactériennes et essentielles à la croissance. Ces enzymes pourraient alors être la cible des antibiothérapies du futur.

  • Les transporteurs ABC d’antibiotiques

La résistance des microbes aux traitements actuels est un fléau majeur en santé humaine et un des mécanismes principaux utilisés par les bactéries pour lutter contre les antibiotiques est la présence de pompes membranaires capables d’expulser en permanence les médicaments hors des cellules. Certaines de ces pompes sont capables de reconnaître des molécules de nature extrêmement diverse et confèrent ainsi à la bactérie un phénotype de résistance à des drogues multiples (phénotype MDR pour ‘MultiDrug Resistance’). De manière intéressante, des pompes similaires sont trouvées chez des organismes pathogènes eucaryotes tels que les parasites et les levures et sont responsables de résistances aux antiparasitaires et antifongiques. De plus, dans certains types de cancer, des transporteurs humains homologues reconnaissent et rejettent les substances anticancéreuses et sont ainsi responsables de l’échec des chimiothérapies. Tous ces transporteurs MDR apparentés appartiennent à la plus grande superfamille de transporteurs, présents dans tous les règnes du vivant, les transporteurs ABC (pour ‘ATP-Binding Cassette’). Ces transporteurs sont capables de transporter, soit importer soit exporter, une multitude de substrats allant des sucres, des acides-aminés, des ions, des molécules organiques hydrophobes de nature variée, jusqu’à des protéines de très grande taille (> 100 kDa). Chez l’homme, le dysfonctionnement de plusieurs transporteurs ABC conduit à des maladies génétiques sévères comme la mucoviscidose, l’adrénoleucodystrophie ou l’hyperinsulinisme congénital.
Si la plupart des transporteurs ABC sont spécifiques d’un substrat donné, d’autres en revanche, comme les transporteurs de type MDR, reconnaissent des substrats de nature très différente (Fig. 1). Tous les transporteurs ABC possèdent une topologie semblable et sont formés de quatre domaines, deux transmembranaires et deux extra-membranaires, qui sont portés soit par un seul polypeptide soit par des polypeptides différents (jusqu’à 4). L’hydrolyse de l’ATP, par un mécanisme vraisemblablement commun à tous les transporteurs ABC, aboutit à l’ouverture du domaine transmembranaire permettant ainsi le passage du substrat.

Figure 1. Structure modulaire des transporteurs ABC. De gauche à droite, l’oligopeptide perméase, l’histidine perméase, l’importateur de vitamine B12, MsbA : l’exportateur de lipide A, la glycoprotéine-P qui exporte de nombreuses drogues utilisées en chimiothérapie et CFTR responsable, quand il est muté, de la mucoviscidose. Les importateurs possèdent une sous-unité additionnelle impliquée dans la capture extracellulaire du substrat (sous-unité A, J ou F).

Nous cherchons à comprendre le mécanisme de fonctionnement de transporteurs ABC bactériens d’antibiotiques. Le premier, BmrA (pour ‘Bacillus multidrug resistance ATP’) est constitutivement exprimé chez Bacillus subtilis et il a été surexprimé de façon hétérologue chez E. coli. Après purification, sa structure a été déterminée à basse résolution (25Å) et dans un environnement membranaire par cryo-microscopie électronique (coll. Daniel Lévy, Institut Curie, Paris). BmrA s’associe in vitro en oligomère pour former deux types d’assemblages supra-moléculaires en double precision precision precision precision precision precision precision precision roulette contenant au total 24 ou 39 homo-dimères (Fig. 2). Au sein de ces dimères, BmrA adopte une conformation ouverte à l’état de repos où ses deux domaines nucléotidiques sont physiquement séparés. Par ailleurs, bien que cette structure oligomérique soit purement artificielle, elle nous a permis d’étudier l’effet produit par l’addition de différents effecteurs de BmrA. Ainsi, l’ajout d’ATP/Mg qui induit la dimérisation des deux domaines nucléotidiques de BmrA, provoque un changement de conformation suffisant pour conduire à l’éclatement des roulettes. Ce résultat est en accord avec l’hypothèse que cette étape de dimérisation des NBDs ATP-dépendante génère assez d’énergie pour permettre le transport des drogues.

 
 
Figure 2. Modèle 3D de roulette de BmrA dans un environnement lipidique obtenue par cryo-microscopie électronique et positionnement manuel de domaines de transporteurs ABC. A gauche, en haut, une roulette est constituée de l’empilement de deux anneaux qui sont chacun formés par l’association de 12 homodimères de BmrA ; deux homodimères sont indiqués par 1,2 et 1’,2’. Les trois domaines du transporteur sont colorés en blanc (NBD), en vert (“intracellular domain”) et en bleu (TMD). La barre noire représente 5 nm. A gauche en bas, l’enveloppe 3D d’un homodimère de BmrA est ‘remplie’ par la structure 3D du transporteur MDR de souris (P-gp). A droite, roulette vue de dessus. Chaque lobe observé à la surface de la roulette correspond à un NBD. Deux NBD d’un homodimères sont ‘remplie’ par les NBD de la P-gp (en haut) dans la même orientation que celle à gauche de la figure ou par deux NBD de Tap1 (en bas) dans une orientation différente (coll. D. Lévy, Institut Curie).

Par ailleurs, des expériences d’échange Hydrogène/Deutérium couplé à la spectrométrie de masse ont permis de montrer qu’à l’état de repos (ou conformation ouverte), BmrA est très flexible et peut adopter de multiples conformations alors que dans un état ATP lié (ou conformation fermée) cette structure est très rigide. Cette grande flexibilité à l’état de repos pourrait ainsi permettre au transporteur de s’adapter à la nature très variée des molécules transportées (Fig. 3). 


Figure 3. Echange H/D de peptides visualisés sur des modèles 3D de BmrA. Modèles 3D de BmrA dans la conformation ouverte (à gauche) ou fermée (à droite). Une sous-unité a été colorée en beige et l’autre en gris clair. Les peptides identifiés sont dessinés en couleurs arc-en-ciel (pour une sous-unité et tous les ICD) selon leurs pourcentages d’échange de deutérium après 3600 s (échelle d’échange montrée à droite en %).

Plus récemment, nous avons initié la caractérisation de nouveaux transporteurs putatifs d’antibiotiques. Contrairement à BmrA, ces transporteurs fonctionnent sous la forme d’hétérodimère ce qui leur confère une asymétrie structurale et donc fonctionnelle (les deux sites ATP sont non équivalents). Chez Bacillus subtilis, le transporteur BmrC/BmrD est capable de transporter de multiples drogues et sa synthèse est induite par de nombreux antibiotiques. Le transporteur homologue présent chez Streptococcus pneumoniae lui confère une résistance aux fluoroquinolones in vitro (coll. Thierry Vernet, IBS, Grenoble) mais également in vivo chez des patients infectés par cette bactérie. 

Enfin, nous avons initié l’étude d’un nouveau transporteur ABC de Streptococcus pneumoniae qui fonctionne de concert avec un système à deux composants (histidine kinase et régulateur de réponse) pour rendre la bactérie résistance à divers peptides antimicrobiens (coll. avec les groupes de Thierry Vernet et Franck Fieschi, IBS, Grenoble). Nous cherchons à identifier le rôle physiologique de ce transporteur et son lien éventuel avec la virulence lors de l’infection.

Collaborations sur les transporteurs ABC de multiples drogues
- Thierry Vernet et Franck Fieschi, IBS, Grenoble
- Pierre Falson et Attilio Di Pietro, BMSSI, Lyon
- Carole Gardiennet et Anja Böckmann, BMSSI, Lyon
- Daniel Lévy, Institut Curie, Paris
- David Cafiso, Univ. of Virginia, Charlottesville, USA

  • Nouvelles ATPases/GTPases bactériennes

La résistance aux antibiotiques traditionnels prend actuellement des proportions inquiétantes et, pour lutter contre ce phénomène, une des solutions consiste à identifier des nouvelles enzymes bactériennes essentielles à la croissance et qui pourront être ciblées par de nouveaux inhibiteurs. Dans notre équipe, nous avons initié l’étude de trois de ces nouvelles familles d’enzymes bactériennes, qui sont répandues chez la plupart, voire la totalité, des espèces pathogènes. Deux sont des GTPases (YphC et YsxC chez Bacillus subtilis) et nous avons montré (coll. avec Robert Britton, Michigan State University, USA) qu’elles sont vraisemblablement impliquées dans la biogenèse de la grande sous-unité du ribosome bactérien (50S) (Fig. 4)


Figure 4. Rôle des deux GTPases, YsxC and YphC, dans la biogenèse du ribosome bactérien. YsxC et YphC sont impliquées dans la biogenèse du ribosome car la déplétion de chacune des deux enzymes génère un ribosome avec la grosse sous-unité ayant une taille réduite (45S vs 50S). Ce ribosome ‘chétif’ a tendance à se dissocier en chacune de ses deux sous-unités constitutives, la 45S et la 30S.

Dans le cas de YsxC, nous avons identifié certains de ses partenaires protéiques qui appartiennent à la sous-unité 50S. Concernant YphC, il s’agit d’une GTPase tout à fait particulière puisqu’elle possède deux domaines de fixation du GTP en tandem. Nous avons récemment obtenu deux structures 3D à haute résolution de YphC, qui nous permettent d’émettre des hypothèses quant au rôle de chacun des deux domaines GTPases dans le fonctionnement de cette enzyme (coll. avec Dominique Housset, IBS, Grenoble). Enfin, la troisième famille d’enzymes (YdiB chez B. sutilis) concerne une nouvelle classe d’ATPases essentielles, de fonction encore inconnue, et qui possède la capacité à s’assembler en homo-oligomères à la fois in vitro et in vivo (coll. E. Brown, McMaster Univ.). Nous recherchons actuellement des partenaires de cette nouvelle famille d’enzymes qui pourraient nous renseigner sur leur rôle au sein des bactéries (coll. Christophe Grangeasse, BMSSI, Lyon).

Collaborations sur les nouvelles enzymes bactériennes :
- Guy Schoehn, IBS, Grenoble
- Dominique Housset, IBS, Grenoble
- Christophe Grangeasse, BMSSI, Lyon et Anne Galinier, LCB, Marseille 
- Robert Britton, Michigan State University, USA
- Eric Brown, McMaster University, Canada