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Séquençage N-terminal
Analyse d'acides aminés
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Dominique MAZZOCUT

IBCP-Centre Commun de Séquençage
7, passage du Vercors - 69367 LYON Cedex 07

Tél. 04 72 72 26 63      Fax. 04 72 72 26 04
e-mail : seq-aaa@ibcp.fr
 

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Nous vous demandons de respecter les conditions suivantes :

Echantillons purifiés, lyophilisés, en solution (eau, TFA, acétonitrile) ou transférés sur PVDF (nous recommandons l'utilisation de membranes performantes : ProBlott, Immobilon Psq ou équivalent, coloration Bleu de Coomassie R250 ou Ponceau S).

Pour les échantillons en solution, le volume doit être < 50 ml (pas de sels, ni de détergents).

Les échantillons doivent être expédiés en tubes type Eppendorf étiquetés clairement.
 
 

Vos résultats

Les résultats des analyses vous sont expédiés par courrier ou e-mail. Les graphes, tableaux de données et archives de validation des instruments et des réactifs peuvent vous être expédiés sur demande.

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Le séquençage N-terminal d'un peptide ou d'une protéine consiste à réaliser une dégradation récurrente à partir de l'extrémité N-terminale (chimie díEdman). A chaque cycle de dégradation, l'acide aminé en position N-terminale est libéré sous forme díun dérivé phénylthiohydantoïne (PTH amino acide). Chaque PTH amino acide formé est alors analysé par HPLC microbore en phase inverse, ce qui permet son identification. Chaque cycle de la chimie dure environ 30-35 min. avec l'appareillage utilisé (Procise Applied Biosystems). Si la protéine est bloquée en N-terminal (plus de 50% des cas), on n'obtient aucune donnée.

La chimie d'Edman automatisée comprend 3 étapes :

1.  Couplage du phénylisothiocyanate (PITC) sur l'amine en a de la protéine à pH 9-10, formant un groupement phenylthiocarbamyle (PTC).
2.  Clivage par l'acide trifluoroacétique (TFA) anhydre, générant un acide aminé-anilinothiazolinone (ATZ).
3.  Conversion de ce dérivé ATZ à pH acide en une forme stable phénylthiohydantoïne (PTH)

Durant ces étapes, les excès de réactifs et les produits formés par les réactifs sont éliminés par des lavages successifs.
Enfin, les dérivés PTH sont analysés par HPLC microbore en ligne.
Il est à noter que la cystéine est détruite si elle n'a pas subi de transformation préalable (réduction/alkylation).

Le Centre Commun de Séquençage de l'IBCP dispose de deux séquenceurs automatiques Applied Biosystems : Procise 492A et 473 A. Ces systèmes permettent d'analyser respectivement des quantités de 1-100 pmoles (Procise) et de 50-500 pmoles (473 A) de protéine/peptide. Si l'échantillon est en solution, il sera déposé sur un disque de fibre de verre et retenu par interaction hydrophobe à l'aide d'un polymère (Biobrene). On peut analyser directement les protéines/peptides transférés sur membrane PVDF. Pour des analyses spécifiques, il est possible de coupler un collecteur de fractions piloté par les séquenceurs.
Le logiciel 610 A intégré permet l'analyse des chromatogrammes et fournit une aide à la détermination de la séquence.

La performance d'un séquenceur pour un échantillon spécifique est  caractérisée par le rendement initial, le rendement répétitif, le "lag" ou carry-over et le bruit de fond.
Le rendement initial  (30-60% en général) représente la quantité d'acides aminés mesurée au premier cycle de la dégradation et exprimée sous forme de pourcentage de la quantité totale analysée (si elle est connue).
Le rendement répétitif (en général 90-98%) indique la proportion d'acides aminés mesurée à chaque cycle. Il dépend, d'une part, de l'instrument et, d'autre part de l'échantillon lui-même.
Le lag ou carry-over représente la quantité d'acide aminé de rang "n" présent au rang "n+1".
Le bruit de fond correspond à des traces d'acides aminés dues à des clivages incomplets ou à des coupures internes de l'échantillon. Ce bruit de fond augmente avec le nombre de cycles effectués.

La longueur de lecture dépendra donc de ces 4 facteurs, la lecture ne sera plus possible lorsque le bruit de fond sera supérieur au signal produit par les acides aminés. Selon les protéines et la quantité analysée, on pourra donc lire de quelques acides aminés à plusieurs dizaines.
 

La page web :http:// www.hsc.virginia.edu/research/biomolec/seqguid4.htm  avec, en prime, une bibliographie complète et tenue à jour.
 

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L'analyse de la composition en acides aminés d'une protéine ou d'un peptide consiste en un dosage simultané, après hydrolyse totale, de tous ses acides aminés.
On obtient donc à la fois une information qualitative (composition relative) et quantitative (concentration).
Les deux méthodes les plus courantes font appel à la dérivation des acides aminés avant (dérivation pré-colonne) ou après  (post-colonne) séparation par chromatographie.

Le Centre Commun est équipé d'un analyseur automatique Beckman 6300, utilisant la dérivation par la ninhydrine après séparation par chromatographie échangeuse díions.
Cet appareil permet díanalyser des quantités à partir de 10 mg de protéine.

L'hydrolyse totale est réalisée avec un mélange HCl-TFA (acide trifluoroacétique) en phase vapeur.

Après analyse, le logiciel intégré permet la quantification et un tableau Excel dédié présente les résultats .

La page web  http:// abrf.org/ABRF/ResearchComitee/aaaarticles/aaafiles/4c.html  propose un guide « Tutorial#1 » qui précise les règles et les domaines clés de l'analyse d'acides aminés.

SEQ :            prise en charge        210 € HT                par résidu identifié  45 € HT

AAA :           par analyse                  95  € HT

 

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