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Thèse et HDR soutenues durant la période 2010-2019
2011
DOS SANTOS Morgan [2-11-2011] Dir : P. ROUSSELLE
Rôle des protéoglycannes à héparane sulfate des lames basales au cours du vieillissement cutané
PHD University
Resume :
Parmi les protéoglycannes à héparane sulphate (HSPGs) des lames basales, le perlécane présente un rôle majeur dans la morphogénèse de l’épiderme mais également dans la survie et la différenciation des kératinocytes. Celui‐ci régulerait ces processus en contrôlant la biodisponibilité des facteurs de croissance. Au cours de ce travail, nous avons étudié l’expression du perlécane dans la peau humaine au cours du vieillissement intrinsèque et son implication dans les défauts de l’épiderme liés à l’âge.
Une analyse immunohistologique sur une cohorte de peau normale
humaine provenant de donneurs allant de 22 à 73 ans, a révélé une
diminution drastique du perlécane au niveau de la jonction
dermo‐épidermique et des capillaires dermiques au cours de l’âge. Des
études biochimiques combinées à des analyses génomiques ont pu démontrer
que la diminution de l’expression du perlécane n’était pas due à une
dégradation de la protéine mais à une diminution de sa régulation
transcriptionnelle par les kératinocytes. Par ailleurs, la conception et
la caractérisation de modèles de peaux reconstruites in vitro combinant
des cellules provenant de différents âges a permis d’établir une
corrélation entre le défaut de synthèse du perlécane et l’épaisseur de
l’épiderme. Nous avons montré que l’addition de perlécane natif purifié
dans le milieu de culture d’un modèle contenant des kératinocytes âgés a
permis de restaurer l’architecture épidermique. L’ensemble de ces
résultats démontre ainsi l’importance du perlécane dans l’homéostasie
cutanée.
Un criblage de composés a permis la sélection de molécules candidates
capables de restaurer spécifiquement l’expression du perlécane dans des
cultures de kératinocytes et de cellules endothéliales microvasculaires
dermiques âgés.
Des tests fonctionnels sur les modèles de peaux reconstruites
précédemment mis au point, ont permis de démontrer leur capacité à
améliorer la morphogénèse de l’épiderme en accord avec les fonctions du
perlécane d’origine épithéliale.
L’ensemble de nos résultats indique qu’une diminution significative
de synthèse du perlécane par les kératinocytes au cours de l’âge
participe à l’affinement et aux défauts de différenciation de l’épiderme
observés durant le vieillissement cutané.
CARULLI Sonia [18-07-2011] Dir : P. ROUSSELLE
Bases moléculaires de l’adhésion cellulaire à la Laminine 332 par le syndécan-1
PHD University
Resume :
L’interaction du récepteur syndecan-1 de la famille des héparanes
sulfates protéoglycannes avec le fragment carboxy-terminal alpha3LG4/5
de la protéine d’adhérence matricielle, la laminine 332, induit une
réorganisation du cytosquelette de la cellule conduisant à la formation
de microspicules, caractéristiques de la migration cellulaire. Notre
laboratoire a mis en évidence que l’adhésion cellulaire syndecan-1
dépendante implique les chaînes d’héparanes sulfates et chondroitine
sulfate. Afin d’identifier le (les) zone(s) impliquée(s) dans
l’interaction domaine LG4/5-syndécan-1, une approche de mutagenèse
dirigée a été mise en place sur le fragment LG4/5 recombinant. Toutes
les protéines couplées avec l’étiquette 6-Histidine ont été produites
dans des cellules de mammifère, purifiées par chromatographie d’affinité
et caractérisées biochimiquement. L’évaluation de l’affinité des
protéines produites pour l’héparine nous a permis d’identifier un site
d’interaction majeur avec les glycosaminoglycannes dans le domaine
LG4/5. La technique de résonance plasmonique de surface et des tests
d’adhérence cellulaire nous ont permis de confirmer ce résultat puisque
l’absence du site d’interaction majeur avec l’héparine a produit une
inhibition totale de l’adhérence. Des expériences de pull-down nous ont
montré que ce site est aussi impliqué dans l’interaction avec le
syndecan-4, indiquant que cette séquence pourrait ainsi jouer un rôle
dans différents processus cellulaires. A l’aide d’un modèle structural
du domaine LG4/5 nous avons montré que la zone identifiée est localisée
dans une boucle exposée à l’extérieure du module LG4, entourée par des
résidus à plus faible affinité.
MOALI Catherine [08-06-2011]
HDR
2010
CLAUS Stéphanie [14-12-2010] Dir : F. MALLEIN-GERIN
PHD University
Le but de cette étude était d’évaluer si la Bone Morphogenetic Protein (BMP)-2 pouvait aider à contrôler le phénotype de chondrocytes humains dans des conditions de culture à long terme nécessaires pour la Transplantation de Chondrocytes Autologues (TCA). Nous avons aussi évalué le potentiel de la BMP-2 comme facteur de réparation du cartilage, en combinaison avec un biomatériau à base de collagène, pour étendre la technique aux lésions arthrosiques. Des chondrocytes humains ont été cultivés selon la procédure utilisée pour la TCA. Nous avons évalué la réponse des chondrocytes à la BMP-2 en culture monocouche ou dans les éponges de collagène par des analyses par PCR en temps réel, par Western blotting et Immunohistochimie. L’ajout de BMP-2 améliore le caractère chondrogénique des chondrocytes humains amplifiés en monocouche. L’effet stimulateur de la BMP-2 sur l’expression du collagène de type II a été observé au niveau des gènes mais aussi des protéines, ce qui est une propriété essentielle pour la reconstruction d’une matrice cartilagineuse. Nos résultats ont aussi montré que dans des chondrocytes tout d’abord amplifiés en monocouche puis cultivés en éponges de collagène en présence de BMP-2, la BMP-2 est capable de restaurer l’expression du gène COL2A1 et la synthèse de collagène de type II qui avaient été perdues pendant l’amplification. De manière importante, aucun signe de maturation hypertrophique ou d’induction ostéogénique n’a été détecté. Cette étude est la première à révéler le bénéfice de l’ajout de BMP-2 à des chondrocytes humains comme un agent thérapeutique pour la réparation du cartilage. MOTS-
WEBER Caroline [10-12-2010] Dir : B. VERRIER
PHD University
Les vecteurs nanoparticulaires comme systèmes de relargage contrôlé pour des applications vaccinales font l’objet d’intenses recherches, notamment dans le domaine du VIH-1. Une approche novatrice consiste à co-administrer des molécules immunostimulatrices avec les antigènes d’intérêt, afin d’amplifier le recrutement et l’activation des cellules dendritiques (DCs). Un tel vecteur vaccinal stimulerait l’intensité de la réponse immunitaire et une immunité au niveau des muqueuses vaginales et anales pourrait être obtenue après vaccination. Des nanoparticules de poly(acide lactique) (NP-PLA) ou de chitosane/sulfate de dextrane (NP-CSD) ont été utilisées comme véhicules et adjuvants de protéines du VIH-1, gp140 et p24. Le poly(I:C), ligand de TLR3 est la molécule immuno-stimulatrice retenue pour ses propriétés adjuvantes. Les NP-PLA et NP-CSD présentent un potentiel équivalent pour l’adsorption de protéines. Par contre, si les NP-CSD permettent l’adsorption du poly(I:C) (95%), elle est moins reproductible sur les NP-PLA. Pour chaque formulation, la capacité à induire in vitro la maturation des DCs a été évaluée en suivant les marqueurs CD25, CD80, CD83, par cytométrie en flux. L’adsorption de poly(I:C) sur les NP-PLA ou les NP-CSD amplifie les capacités de maturation de ces nanoparticules, un effet synergique étant observé avec les NPCSD. Nos travaux montrent que la co-adsorption d’un TLR ligand, avec des antigènes protéiques du VIH sur des nanoparticules biodégradables, est possible et confère à la formulation vaccinale un effet immuno-stimulant in vitro. In vivo, les formulations vaccinales contenant du poly(I:C) induisent de très forts taux d’anticorps sériques chez la souris.
PEZ Floriane [17-09-2010] Dir : P. SOMMER & C. REYNAUD
PHD University
Au sein d’une tumeur des régions hypoxiques se forment ce qui conduit à l’activation du facteur de transcription HIF1. HIF1, composé des deux protéines HIF1a et HIF1b, permet l’adaptation des cellules à des faibles concentrations d’oxygène en activant la transcription de gène cible. Un de ces gènes est celui codant pour la lysyl oxydase (LOX). Cette enzyme structure la matrice extracellulaire et est impliquée dans la tumorigénèse. Pour comprendre les liens entre LOX et HIF1a, nous avons modulé leurs expressions dans des lignées humaines de carcinome du côlon. En condition hypoxique, HIF1a contrôle l’expression de LOX et réciproquement, LOX régule la synthèse protéique d’HIF1a via l’activation de la voie de signalisation PI3K/AKT. Nous avons donc mis en évidence l’existence d’une boucle de régulation positive entre LOX et HIF1 en conditions hypoxique. Sachant que ces deux protéines sont des acteurs majeurs de la progression tumorale, nous avons cherché à comprendre le rôle de cette régulation mutuelle dans ce processus. Nos résultats démontrent que l’activité enzymatique de LOX promeut la croissance tumorale in vitro et in vivo et que son action est potentialisée par la présence de son partenaire HIF1a. De plus, LOX et HIF1a agissent en synergie afin d’augmenter la potentiel métastatiques des cellules tumorale de côlon in vitro. Ainsi, ce travail de thèse a permis de mettre en évidence l’existence d’une boucle de régulation entre HIF1a et LOX qui est critique dans la progression tumorale et semble également être impliquée dans le processus métastatiques.
LE PROVOST Gabrielle [05-07-2010] Dir : P. SOMMER
PHD University
La Lysyl Oxydase (LOX) est une enzyme extracellulaire dont le rôle canonique est de catalyser la réticulation des fibres de collagènes et de l’élastine, assurant ainsi l’intégrité des tissus conjonctifs. La LOX agit également dans plusieurs types cellulaires comme régulateur de différents processus biologiques, soulignant des fonctions à la fois extra et intracellulaires. Ces travaux de thèse ont contribué à améliorer la compréhension du rôle de LOX dans l’épiderme, et plus précisément au cours de la différenciation des kératinocytes. Le développement d’un modèle de culture en monocouche à confluence, et d’un modèle tridimensionnel d’épiderme reconstruit ont permis d’aborder l’étude de LOX au cours de l’induction du programme de différenciation des kératinocytes et du processus de différenciation terminale conduisant à la formation d’un épiderme pluristratifié, cornifié et fonctionnel. L’expression de LOX est induite au cours des premières étapes de la différenciation de kératinocytes primaires ainsi que d’une lignée de kératinocytes immortalisés. Grâce à l’établissement de lignées de kératinocytes éteignant l’expression de LOX de façon stable, nous avons mis en évidence l’implication de la protéine LOX, indépendamment de son activité enzymatique, dans la régulation des premières étapes de différenciation des kératinocytes. En absence de LOX, l’initiation du programme de différenciation est perturbée, affectant la différenciation terminale et fonctionnelle des épidermes reconstruits. Ainsi, une régulation fine de l’expression de LOX est nécessaire au déroulement normal du processus de différenciation des kératinocytes, et donc au maintien de l’homéostasie épidermique.
KRONENBERG Daniel [12-05-2010] Dir : DJ HULMES
PHD University
(Thèse en co-tutelle avec l’université de Mainz - Allemagne)
La maturation des collagènes fibrillaires est régulée par la libération protéolytique des propeptides qui conduit à la formation spontanée de fibres, à partir des molécules de collagène mature. Les fibres de collagène ainsi formées confèrent résistance et solidité aux tissus. Les métalloprotéases Tolloïdes sont les principales enzymes responsables de la maturation C-terminale des procollagènes. Ces protéases possèdent de nombreux autres substrats et se distinguent par un mode de régulation original, l’utilisation de régulateurs « substrats-spécifiques », qui leur permet de moduler leur activité vis-à-vis de ces différents substrats. Parmi ces régulateurs, les Procollagen C-Proteinase Enhancers (PCPE-1 et 2) semblent jouer un rôle important car ils augmentent l’activité de clivage du C-propeptide des procollagènes jusqu’à 20 fois. Même si PCPE-1 a été découvert en 1985, son mode d’action n’est toujours pas compris. Le principal objectif de cette thèse était donc de mieux comprendre le mécanisme de l’activation. Nous avons commencé par identifier la région minimale de PCPE-1 capable d’activer les Tolloïdes et démontré une très forte coopérativité entre les domaines de cette région. Par ailleurs, nous avons mis en évidence, pour la première fois, un nouveau rôle physiologique pour le domaine C-terminal de PCPE-1 (NTR). Concernant les autres partenaires du complexe de maturation, nous avons observé une interaction d’affinité modérée entre PCPE-1 et la protéase Tolloïde appelée BMP-1 et montré que PCPE-1 se fixe uniquement sur la partie C-terminale du procollagène. Enfin, nous avons mis en évidence que d’autres métalloprotéases, les Méprines, pourraient également jouer un rôle dans la maturation de collagènes fibrillaires en étant régulées négativement par les PCPEs. L’ensemble de ces résultats nous a permis de proposer un nouveau schéma d’interaction pour les PCPEs et de faire de nouvelles hypothèses concernant leur mécanisme d’action.
ADDAD Sourour [06-01-2010] Dir : C. LETHIAS
PHD University
Resume :